Desain Primer cDNA Katalase dan Optimasi PCR untuk Analisis Ekspresi Gen pada Testis Mencit Model Diabetes Melitus yang Diberi Ekstrak Kayu Manis (Cinnamomum zeylanicum)

Diabetes Melitus (DM) merupakan gangguan metabolik kronis yang memicu kondisi stres oksidatif sistemik, termasuk pada jaringan testis, melalui peningkatan produksi Reactive Oxygen Species (ROS) yang signifikan. Kondisi ini sering kali menyebabkan penurunan kualitas sperma dan gangguan fertilitas pada pria. Gen katalase (CAT) memegang peranan krusial sebagai garda terdepan sistem pertahanan antioksidan seluler yang mengatalisis penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen. Penelitian ini bertujuan untuk merancang desain primer spesifik gen CAT dan menentukan suhu penempelan (Annealing) yang optimal melalui teknik gradient PCR, guna memfasilitasi analisis ekspresi gen pada testis mencit yang diberi perlakuan ekstrak kayu manis. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif. Tahapan penelitian dimulai dengan desain primer secara in silico menggunakan software primer- BLAST dengan referensi accession number NCBI NM_009804.2. Metode dilanjutkan dengan isolasi RNA total dari jaringan testis, sintesis complementary DNA (cDNA), serta optimasi suhu annealing pada rentang 50 °C hingga 60 °C. Data desain primer yang mencakup parameter fisikokimia dan struktur sekunder, serta hasil optimasi suhu dan amplifikasi cDNA gen CAT yang divalidasi melalui elektroforesis gel agarosa, dianalisis secara komprehensif untuk memastikan spesifisitas dan efisiensi amplifikasi yang optimal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pasangan primer yang didesain (Forward: 5’-GATGCCATATTGTTTCCATCC-3’ dan Reverse: 5’- GAATCCCTCGGTCACTGAAC-3’) memiliki parameter bioinformatika yang sangat baik dengan panjang produk PCR sebesar 148 bp. Konsentrasi RNA total yang diperoleh berkisar antara 717,28–1214,0 ng/μL dengan rasio kemurnian A260/280 pada rentang 1,8–2,1, yang mengindikasikan kualitas sampel yang layak untuk tahap amplifikasi. Visualisasi menggunakan elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa suhu annealing 56,7 °C merupakan suhu paling optimal, ditandai dengan munculnya pita DNA yang tunggal, tajam, dan memiliki intensitas cahaya yang kuat tanpa adanya kontaminasi primer-dimer atau pita non-spesifik lainnya. Dengan demikian, primer dan kondisi reaksi yang telah dioptimasi ini memenuhi kriteria validitas untuk digunakan dalam analisis kuantitatif ekspresi gen CAT pada penelitian mengenai intervensi antioksidan terhadap diabetes.